Třiatřicetiletá Nájin a její dcera Fatu, obě narozené ve Dvoře Králové, jsou posledními známými severními bílými nosorožci na planetě. Bez možnosti přirozené reprodukce jsou jedinou nadějí pro tento druh pokročilé technologie asistované reprodukce. Vědci z BioRescue produkují embrya severních bílých nosorožců oplodněním oocytů (vaječných buněk) spermiemi v laboratoři. Embrya jsou poté určena k tomu, aby je odnosily náhradní matky jižních bílých nosorožců. Rozhodující pro produkci embryí je dostupnost oocytů a spermií. Samice Fatu je jedinou dárkyní přirozených oocytů a program má k dispozici zmrazené sperma pouze od čtyř samců, přičemž někteří z nich jsou s Fatu blízce příbuzní. Pomocí technik spojených s kmenovými buňkami (SCAT - stem cell associated techniques) se vědci z BioRescue snaží tento problém překonat: z živé tkáně, např. z kůže nosorožců, je postupně možné vytvořit tzv. indukované pluripotentní kmenové buňky (iPSC – induced pluripotent stem cells), následně primordiální zárodečné buňky (PGC) a nakonec umělé gamete, tedy oocyty a spermie. Tím by se zvýšil počet jedinců, z nichž bude možné založit novou populaci, až na 12 zvířat. V nově publikovaném článku v časopise "Science Advances" je popsáno, jak se týmu BioRescue, jenž je koordinován Safari Parkem Dvůr Králové, jako prvnímu na světě podařilo z embryonálních kmenových buněk (ESC – embryonic stem cells) a z indukovaných pluripotentních kmenových buněk (iPSC), úspěšně kultivovat buňky s vlastnostmi primordiálních zárodečných buněk (tzv. PGCLCs z anglického primordial germ cell-like cells). Pravě ty jsou předchůdkyněmi vajíček a spermií.

U organismů, které se rozmnožují pohlavně, jako například lidé, nosorožci nebo myši, jsou primordiální zárodečné buňky (PGC) embryonálními předchůdci spermií a vajíček, které předávají genetickou a epigenetickou informaci z jedné generace na druhou. Aby se mohly vyvinout z kmenových buněk, potřebují velmi specifické prostředí, ve kterém signály z hormonů nebo proteinů spouštějí morfologickou a funkční přeměnu buněk. Vědcům Masafumi Hayashimu a Katsuhiko Hayashimu a jejich týmu z Ósacké univerzity se poprvé v historii podařilo vytvořit takové prostředí v kultivačním systému pro velké savce. Vytvořili kultivační systémy pro jižního bílého nosorožce, u něhož měli k dispozici embryonální kmenové buňky, a pro severního bílého nosorožce, u něhož použili indukované pluripotentní kmenové buňky získané ze vzorků tkání. Aby uspěli, bylo nezbytné rozpoznat, které signály musejí být do systému zavedeny, v jakém čase a v jakém pořadí, aby se spustil vývoj v PGCLC.

Vědci vycházeli z poznatků získaných při práci s myšmi: V roce 2016 se Katsuhiko Hayashimu a jeho týmu podařilo vytvořit primordiální zárodečné buňky a nakonec zárodečné buňky myší, které byly oplodněny v laboratoři, a narodili se z nich zdraví potomci. V případě bílých nosorožců Hayashi úzce spolupracuje se Sebastianem Dieckem z Platformy pluripotentních kmenových buněk při Max Delbrückově centru a s odborníky na reprodukci Thomasem Hildebrandtem z IZW Berlin a s Cesarem Gallim ze společnosti Avantea.

Opakovaným zdokonalováním procesu získal tým primordiální zárodečné buňky ze severní samice Nabiré, která uhynula v Safari Parku Dvůr Králové v roce 2015. Vzhledem k tomu, že PGC jsou základem všech budoucích gamet, otevírá tento úspěch cestu k produkci funkčních gamet z indukovaných pluripotentních kmenových buněk severních bílých nosorožců, což přispěje k odvrácení jejich vyhynutí. Jakmile bude vytvoření umělých gamet úspěšné, spojí se tento plán s postupy, které BioRescue provádí s přirozenými gametami: Stejně jako v případě oocytů získaných z Fatu a spermií rozmražených ze zmrazených vzorků, budou uměle vytvořená vajíčka a spermie oplodněny in vitro v laboratoři. Vytvořená embrya by pak byla bezpečně uložena v tekutém dusíku do doby, než bude možný jejich přenos do náhradní matky.

Embryonální kmenové buňky jižního bílého nosorožce, které byly v Japonsku použity, pocházejí z laboratoře Avantea v italské Cremoně. Indukované pluripotentní kmenové buňky z Nabiré poskytl tým Sebastiana Dieckeho z Centra Maxe Delbrücka.
Nedílnou součástí všech postupů týmu BioRescue, jenž je mimo jiné dlouhodobě podporován Nadací ČEZ, je neustálé hodnocení všech etických rizik. Tato hodnocení vede Etická laboratoř pro veterinární medicínu, ochranu přírody a welfare zvířat na univerzitě v italské Padově.

Publikace:
Hayashi M, Zywitza V, Naitou Y, Hamazaki N, Goeritz F, Hermes R, Holtze S Lazzari G, Galli C, Stejskal J, Diecke S, Hildebrandt TB, Hayashi K (2022): Robust induction of primordial germ cells of white rhinoceros on the brink of extinction. Science Advances. DOI: 10.1126/sciadv.abp9683


Citace:

Masafumi Hayashi, Osaka University:
„Je to vůbec poprvé, kdy se podařilo vytvořit z kmenových buněk primordiální zárodečné buňky velkého ohroženého druhu savců. Dříve se to podařilo pouze u hlodavců a primátů. Na rozdíl od hlodavců jsme při indukci PGC nosorožců identifikovali jako klíčového hráče gen SOX17. SOX17 hraje zásadní roli také při vývoji lidských zárodečných buněk - a tím, pravděpodobně, i u mnoha dalších druhů savců.“

Katsuhiko Hayashi, Osaka University:
„Bylo nesmírně náročné vyvinout kultivační systém, který by poskytoval spolehlivé výsledky, protože přesná souhra všech specifických signálů potřebných k vyvolání požadované buněčné diferenciace je u každého druhu jedinečná. Bylo také nutné potvrdit, že vytvořené buňky s vlastnostmi primordiálních zárodečných buněk jsou geneticky identické s buňkami, ze kterých vznikly - to může být velmi náročný úkol.“

Přemysl Rabas, Safari Park Dvůr Králové:
„Jsme nadšeni, že se vědcům z BioRescue tento průlom podařil a že Nabiré, která uhynula už v roce 2015, je stále součástí mise na záchranu svého druhu. Během svého života bohužel nepřivedla na svět žádného potomka, nicméně vzhledem k nedávným úspěchům spojeným s kmenovými buňkami se zdá být zcela reálné, že se někdy v budoucnu přímý potomek Nabiré ještě narodí a sehraje důležitou roli při znovuosídlení střední Afriky severními bílými nosorožci."

Thomas Hildebrandt, IZW Berlin:
„Od začátku jsme věděli, že spoléhat se pouze na přirozené gamety pro asistovanou reprodukci při záchraně severních bílých nosorožců před vyhynutím nebude z dlouhodobého pohledu stačit. Proto je naprosto klíčové, abychom se snažili o produkci gamet s podstatně vyšší genetickou rozmanitostí a v mnohem větším počtu - dokonce nám to umožní vytvořit embrya z Nájin pomocí umělých gamet, což s jejími přirozenými gametami nebylo možné. Je velmi povzbudivé, že odborníci na kmenové buňky z našeho týmu, z Ósacké univerzity a Centra Maxe Delbrücka pro molekulární medicínu, dosáhli tohoto důležitého kroku už nyní. Je také důležité zmínit, že naše plány na produkci přirozených a umělých gamet nejsou alternativními cestami, kterými bychom se měli vydat, ale jsou cestami, které se propojují a splývají v bodě, kdy se oplodněním in vitro získají potřebná embrya."

Cesare Galli, Avantea
„Úspěšná produkce embryonálních kmenových buněk (ESC) v naší laboratoři v roce 2018, kterou provedla naše kolegyně Giovanna Lazzari z prvních embryí jižních bílých nosorožců, jež se nám podařilo získat, se ukázala jako zásadní pro úspěch práce týmu profesora Hayashiho. Právě ESC jsou již dlouhou dobu studovány a diferencovány a poskytly vzor pro vytvoření kultivačního systému pro vytvoření primordiálních zárodečných buněk z iPSC."

Vera Zywitza, Max Delbrück Center
„Poté, co se nám podařilo vytvořit PGC, musíme nyní přejít k dalšímu obtížnému úkolu: dozrání PGC v laboratoři a jejich přeměnu na funkční vajíčka a spermie. Primordiální buňky jsou ve srovnání se zralými pohlavními buňkami relativně malé a hlavně mají stále dvojitou sadu chromozomů. Musíme proto najít vhodné podmínky, za kterých buňky porostou a rozdělí svou sadu chromozomů na polovinu. U myší jsme zjistili, že při tomto klíčovém kroku byla důležitá přítomnost tkáně vaječníků. Protože tuto tkáň není možné získat ze dvou žijících samic nosorožců, budeme ji pravděpodobně muset vypěstovat také z kmenových buněk.“