Samice Nabiré žila v Safari Parku Dvůr Králové do roku 2015, kdy ve věku 31 let uhynula. Okamžitě po její smrti odborníci zajistili vzorky kůže a tkání a zmrazili je pro pozdější použití. Specialista na kmenové buňky Micha Drukker a jeho tým z Helmholtzova centra v Mnichově a Akademického centra pro výzkum léčiv na Univerzitě v Leidenu uspěli ve vytvoření iPS buněk z této tkáně pomocí metody tzv. epizomálního reprogramování. Vůbec poprvé se jim tak podařilo vytvořit iPS buňky, jež jsou svými vlastnostmi podobné buňkám raného embrya, ze vzorků získaných z nosorožce tak vysokého věku. Vzhledem k tomu, že všichni dárci tkáně severních bílých nosorožců jsou nebo byli relativně vyššího věku, zlepšily se tímto úspěchem i vyhlídky na využití kmenových buněk k vytváření umělých oocytů pro pokročilou asistovanou reprodukci.

Druhým a neméně důležitým posunem v postupném procesu vytváření zárodečných buněk u nosorožců jsou poznatky, které tým získal o dvou stavech pluripotence: iPS buňky mohou být buď tzv. naivní (z anglického naïve-like, tedy v základním stavu pluripotence), nebo tzv. nakročené (v angličtině primed, tyto nakročené iPS buňky jsou považovány za maličko pokročilejší stadium). Experimenty s kmenovými buňkami generovanými z myší přitom ukazují, že iPS buňky se k produkci zárodečných buněk hodí, zejména pokud jsou přeměněné z nakročeného do naivního stavu. Když se však vědci poprvé pokusili převést buňky nosorožce do naivního stavu, buňky nepřežily. Tým proto následně do buněk nosorožců zavedl gen, který zabraňuje buněčné smrti – a díky tomu úspěšně získal naivní iPS buňky.

„Podrobně jsme buňky popsali, mimo jiné, analýzou transkriptomových dat,“ vysvětluje Vera Zywitza, hlavní autorka článku z technologické platformy „Pluripotent Stem Cells“, kterou vede Sebastian Diecke z MDC. "Úspěšná konverze buněk do naivního stavu pluripotence je slibným výchozím bodem pro generování zárodečných buněk."

Nicméně, Vera Zywitza a její kolegové zatím nemohou přejít do další fáze. „Buňky, které jsme kultivovali, obsahují přetrvávající cizí genetický materiál, jmenovitě reprogramovací faktory a gen, který brání buněčné smrti,“ vysvětluje Vera Zywitza. „To znamená, že je nemůžeme použít k vytvoření zárodečných buněk, protože existuje riziko, že by mohly být patologicky pozměněny." Mezitím tým Sebastiana Dieckeho vygeneroval další iPS buňky. K zavedení reprogramovacích faktorů použili místo plazmidů RNA viry. Tyto nové iPS buňky neobsahují nic, co tam nepatří. Nyní se z nich vědci snaží vytvořit primordiální zárodečné buňky. „Tato práce významně přispívá k pochopení pluripotence, tedy schopnosti kmenových buněk přeměnit se na jakoukoliv tělesnou buňku,“ dodává Vera Zywitza. „Je to velmi slibný začátek pro kultivaci zárodečných buněk a také významný milník v oblasti vývoje oocytů nosorožců v laboratoři.“

Přirozené rozmnožení severního bílého nosorožce už není možná, protože na světě už zbývají pouze dvě samice, Nájin a Fatu, obě narozené ve Dvoře Králové. Konsorcium BioRescue však pracuje na metodách, které by mohly, i přes nepříznivé okolnosti, rozmnožování umožnit. Od samice Fatu jsou pravidelně odebírány tzv. oocyty (nezralé vaječné buňky), které jsou následně v laboratoři Avantea oplodněny rozmraženým spermatem z už uhynulých samců. Týmu se zatím podařilo vytvořit 14 embryí, která jsou teď uložena v tekutém dusíku. V současné době tým BioRescue vyvíjí metodu, jak embrya implantovat samicím nosorožce bílého jižního, které by pak fungovaly jako náhradní matky pro nosorožce bílé severní.

„Každý krok této mise je zcela neprobádaným vědeckým územím, obzvláště pak omezená dostupnost oocytů a velmi nízká genetická diverzita zastoupené populace jsou velkou výzvou,“ říká vedoucí projektu BioRescue Thomas Hildebrandt z IZW Berlin. Oocyty bylo možné úspěšně získat a oplodnit pouze od jednoho jedince, proto se hledají nové strategie pro získání vyššího počtu oocytů od několika nepříbuzných zvířat. V rámci BioRescue vyvíjejí MDC a Univerzita Kjúšú spolu s partnery, jako je Helmholtz Zentrum München, nové metody produkce gamet (vajíček a spermií) z kožních buněk. V roce 2016 se profesoru Katsuhiko Hayashimu z Univerzity Kjúšú podařilo vytvořit oocyty z kůže myší, uměle je oplodnit a poté implantovat do myších samic. Myši, které vznikly touto metodou, byly zdravé a plodné.

„Pokud bychom uspěli v tomtéž u severního bílého nosorožce, mohli bychom zastavit sběr vajíček od živých zvířat a zároveň tvořit embrya ve větším počtu,“ dodává Thomas Hildebrandt. „Tato strategie by zároveň výrazně rozšířila počet zvířat, která bychom mohli použít k produkci embryí.“ V současné době je vytváření embryí omezeno na jednu samici, která je dárkyně vajíček, a čtyři samce, jejichž sperma bylo v minulosti prokazatelně zmrazeno. Buněčné kultury, z nichž by teoreticky bylo možné vytvořit iPS buňky a následně zárodečné buňky, jsou zachovány od sedmi dalších severních bílých nosorožců – například od Nabiré.

Všechny postupy konsorcia BioRescue, jehož činnost je mimo jiné podporována Nadací ČEZ, procházejí velmi důkladným etickým posouzením, aby bylo možné systematicky vyvažovat dobré životní podmínky zvířat a přínos procedur k zachování živočišného druhu. To je zvláště důležité při vývoji zcela nových technologií pro ochranu přírody, jež překračují současné hranice poznání. Součástí týmu BioRescue je proto i skupina odborníků na etické posouzení práce s divokými zvířaty vedená Barbarou de Mori z Padovské univerzity. Tento tým posuzuje i procedury souvisejících s kmenovými buňkami v rámci BioRescue a bude i nadále úzce doprovázet jakýkoli další krok této mise.

V následujících měsících a letech se budou odborníci z konsorcia BioRescue snažit reprogramovat iPS buňky tak, aby se z nich skutečně vyvinula vajíčka nebo spermie. Pokud by se to podařilo, BioRescue bude pokračovat v dosavadním přístupu. Dozrálé oocyty vytvořené v laboratoři by byly oplodněny pomocí metody ICSI a vyvinuly by se v embrya severního bílého nosorožce. Tato embrya by musela být uložena v kapalném dusíku do doby, než by mohla být implantována do náhradní matky. „Přístup pomocí kmenových buněk je nesmírně důležitým kouskem skládačky pro celou naši misi, ale nezbavuje nás povinnosti zvládnout další náročné kroky, jako je například přenos embrya, a tedy vytvoření náhradního těhotenství,“ uzavírá Thomas Hildebrandt.

Publikace:
Zywitza V, Rusha E, Shaposhnikov D, Ruiz Orera J, Telugu N, Rishko V, Hayashi M, Michel G, Wittler L, Stejskal J, Holtze S, Göritz F, Hermes R, Wang J, Izsvak Z, Colleoni S, Lazzari G, Galli C, Prof. Hildebrandt TB, Hayashi K, Diecke S & Drukker M (2022): Naïve-like pluripotency to pave the way for saving the northern white rhinoceros from extinction. Sci Rep 12, 3100 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-07059-w